BiFC技术服务
蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI)是细胞内许多生物过程的基础，如信号转导、代谢调控、免疫应答和基因转录翻译等。研究蛋白质间的相互作用对于阐明蛋白质的生物功能以及分子作用机理具有重要的意义。
蛋白质间相互作用研究的方法众多，双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescent Complimentary, BiFC) 是一种直观、快速判断目标蛋白在活细胞中的相互作用和定位的技术，因其直观性使得 BiFC 技术迅速获得应用，已经成为检测活体细胞中蛋白质相互作用的一种常规方法。
BiFC技术基于蛋白质片段互补的原理，将荧光蛋白多肽链在某些不保守的氨基酸处切开，形成两个互补但各自不发荧光的 N-末端和 C-末端片段。将它们分别连接到待验证互作的两个蛋白质A和B上，在细胞内共表达这两个融合蛋白时，由于蛋白质A与蛋白质B发生相互作用，荧光蛋白的两个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，从而产生荧光，通过荧光显微镜可直观地观察到蛋白质间的相互作用。
我们的技术优势
✅ 活细胞内检测：细胞生理状态下直接观察蛋白质相互作用，保留了时空动态信息。实验结果更加直观和易于理解。
✅ 高特异性：只有当目标蛋白相互作用时，荧光信号才会出现，减少了假阳性结果，提高了检测的特异性。
✅ 高灵敏度：检测弱或瞬时相互作用，对低亲和力、短暂相互作用敏感，能够揭示一些传统方法难以检测到的相互作用。
✅ 实验经验丰富：浦芥专注于植物细胞样本分析
实验流程
服务内容
服务说明
1. 浦芥的BiFC实验只在烟草中进行验证，默认设置1个实验组和2个阴性对照组。判定实验成功的标准：实验组有荧光，而阴性对照无荧光。若实验组检测到荧光，说明两个蛋白能够互作，反之说明不互作。
2. 为保证烟草转化效率，本公司不接受客户提供的农杆菌。
3. 浦芥提供多组BiFC载体，方便选择使用。载体选择参见表 《浦芥生物BiFC可用载体列表》。
浦芥生物BiFC可用载体列表
4. 客户如有特殊检测要求，双方协商具体服务事项。BiFC技术服务内容包括：基因克隆、载体构建与验证、农杆菌转化、烟草瞬时转化、共聚焦显微镜观察拍照。各项目可整体检测也可单独检测。
5. 收费方式：后付费，零预收费启动项目。BiFC实验不成功仅收取载体构建费用。待项目完成数据交与客户认可后，30日内开具发票，转账付费。
6. 结果确认。客户收到本公司的结题报告后，请务必在7日内确认结果，如有问题及时反馈售后人员，到期如无异议，默认该项目成功。
7. 本合作仅限于为科研单位或个人提供BiFC技术服务，所交付的产物仅作为实验室的研究材料使用，不具备商业用途，合作双方应在国家相关法律法规允许的范围内使用，违者对产生的后果自行负责，本公司不承担任何连带责任。
客户提供材料
1. 待验证互作蛋白的基因序列，名称等注释信息，如果特别要求请在备注中注明；
2. 如客户提供载体，需提供载体MCS测序报告，如无测序报告则需另外收取测序费用，由本公司代为测序。质粒浓度为>100ng/μl，低温运输，需提供荧光蛋白的颜色或者激发光和发射光波长等信息；
3. 尽可能详细的填写“BiFC技术服务登记表”，发送至售前销售的微信 15301627726 或邮箱 sales01@pujiebio.com；
反馈客户结果
1. 客户委托本公司构建载体，项目结束后提供构建好的载体及相关测序结果；
2. 激光共聚焦显微镜观察拍照。默认1个实验组拍3个视野，2个阴性对照组各拍1个视野，每个视野包含荧光蛋白、DIC、Merge共3张图。
3. 提供包含详细实验步骤、分析整理图片结果的结题报告，以及BiFC激光共聚焦原始图片。《BiFC技术服务结题报告-模板》【注：此模板仅供参考】
案例展示
常见问题及解析（Q&A）
Q：如何确保BiFC实验中检测到的荧光信号反映的是真实的蛋白质相互作用？
A: 为了确保荧光信号的真实性，需要排除假阳性的可能性。假阳性可能是由于荧光蛋白片段的非特异性相互作用或其他非目标蛋白质之间的相互作用引起的。因此，在实验中应设置对照组，如单独表达荧光蛋白片段或目标蛋白的对照组，以排除非特异性相互作用的干扰。也可重复实验，保持每次实验条件（如细胞类型、培养条件、成像参数等）的一致性，比较蛋白质相互作用结果是否一致；此外，还可以结合其他实验方法，如免疫共沉淀（Co-IP）、酵母双杂交（Y2H）、GST pull-down和荧光素酶蛋白互补实验（LCA）等，以多角度、多层次地验证蛋白质相互作用的真实存在。
Q：BiFC结果无信号或信号弱可能的原因是什么？怎么解决？
A: 可能的原因有多种。首先，确认载体是否有问题，荧光蛋白选择是否合适，融合蛋白设计有无缺陷，甚至可以对调N端和C端的目的基因。其次，有些基因表达时间长，在原生质体中表达不明显，可以尝试在烟草体系中表达，且适当调节观察时间，以便观察到更明显的结果。同时，确定激光共聚焦显微镜观察是否有失误。此外，烟草状态不佳也可导致农杆菌侵染效率低，蛋白表达弱，进而影响荧光信号。唯地生物常年供应烟草活体苗，可联系相关负责人15301627726索取。
针对无信号的情况解决方法有：① 建议优化、升级载体系统，并检查融合蛋白的表达情况；② 优化、调整实验体系，延长培养时间，增加菌液浓度，提高乙酰丁香酮用量。③ 在制片过程中，应彻底清理干净叶片表面杂质，排除气泡，以减少背景干扰。④ 适当调节观察时间，分时段检测（24h/48h/72h），弱表达蛋白需延长至96小时。如果以上原因都已验证排除，还是没有荧光信号，可能是所研究的蛋白质之间确实不存在相互作用，因此无法形成完整的荧光蛋白。
Q：为什么有些基因预测互作且在酵母双杂中显示互作，但BiFC结果显示无信号？
A: 由于在酵母双杂实验中BD融合诱饵蛋白有单独激活作用，且AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合，也可以单独激活报告基因的表达，导致最后的实验结果出现假阳性。有些重组还可能会破坏蛋白之间的互作，且不同外源基因的瞬时表达效率大不相同，建议在BiFC之前先做个亚细胞定位评价一下两个基因的表达效率，以便调整两个质粒的转化条件。
Q：在烟草BiFC中什么样的光才算有效光？
A: 在制片过程中时，尽可能清理干净叶片表面的杂质，排除气泡。看显微镜时，激发光电压不能打得太高，初始功率设置为设备最大功率的 1-5%（如50mW激光器使用0.5-2.5mW），逐步增加至最低有效信号强度，烟草细胞的轮廓清晰可见，且分布均匀。
有效信号必须严格匹配BiFC复合物重构荧光蛋白的特征波长（如Venus-YFP的激发488nm/发射500-550nm）。信噪比（SNR）≥3（ImageJ定量分析）。与阴性对照（单独VN/VC片段）强度差异＞5倍。有效信号必须呈现符合生物学逻辑的空间分布特征，比如膜蛋白应在细胞边缘形成连续轮廓，核蛋白则与DAPI共定位。真正的互作信号会在多次实验中稳定出现，且强度随时间增强（荧光蛋白正确折叠需要时间），培养24-48小时观察，与荧光蛋白成熟周期相符，若信号在12小时就强烈出现，反而可能是假阳性。无效信号特征：荧光强度随时间骤降（10分钟内＞50%），细胞形态变形（如液泡破裂）。Q：一个蛋白的普通定位和两个蛋白的BiFC定位结果不一致，一个在细胞质，另一个在细胞核？
A:
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