亚细胞定位技术服务

我们的技术优势

✅ 高精度成像系统：共聚焦显微镜 + 超分辨率成像（分辨率达0.1μm），无需额外的标记或处理步骤，实验结果更加直观和易于理解。

✅ 多标记兼容性：支持4通道同步标记（如EGFP/mEmerald(超强绿色荧光)/EYFP/CFP/ RFP/mCherry/DAPI等）

✅ 高表达量的亚细胞定位启动子及配套的不同强度荧光蛋白，这使得即使目标蛋白在细胞内的表达量较低，也能够被清晰地观察到。

✅ 高侵染能力的农杆菌突变体，增加瞬时蛋白表达量

✅ 高效表达异源蛋白的烟草及拟南芥突变体；可以在活细胞中进行实时观察，避免了因处理过程对细胞造成的损伤和改变。

✅ 实验经验丰富：专注于植物细胞样本分析

实验流程

服务内容

服务说明

1. 浦芥免费为客户提供亚细胞定位预测服务，常用预测软件Cell-PLoc、DeepLoc - 2.1及TargetP - 2.0。

软件链接：  http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/

                     https://services.healthtech.dtu.dk/services/DeepLoc-2.1/

                     https://services.healthtech.dtu.dk/services/TargetP-2.0/

Reference:

Kuo-Chen Chou and Hong-Bin Shen, "Cell-PLoc: A package of web-servers for predicting subcellular localization of proteins in various organisms", Nature Protocols, 2008, 3, 153-162.

Practical Applications of Language Models in Protein Sorting Prediction: SignalP 6.0, DeepLoc 2.1, and DeepLocPro 1.0, pp. 153-175 of Dukka B. KC (ed.): Large Language Models (LLMs) in Protein Bioinformatics (MIMB, volume 2941), 2025

José Juan Almagro Armenteros, Marco Salvatore, Ole Winther, Olof Emanuelsson, Gunnar von Heijne, Arne Elofsson, and Henrik Nielsen. Life Science Alliance 2 (5), e201900429. doi:10.26508/lsa.201900429  (Open access)

2. 浦芥建立的丰富的亚细胞定位载体资源，包含了基于绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白的亚细胞定位载体库，方便选择使用。亚细胞定位载体选择参见 《浦芥生物亚细胞定位可用载体列表》。

浦芥生物亚细胞定位可用载体列表

3. 浦芥具有各类细胞器定位的Marker载体，包括细胞核、细胞膜、叶绿体、液泡膜、内质网、高尔基体、自噬小体、过氧化酶体、线粒体等，部分Marker还有多种荧光蛋白，以方便共定位时选择。共定位可用的细胞器Marker参见 《浦芥生物共定位可用的细胞器Marker列表》。

浦芥生物共定位可用的细胞器Marker列表

4. 为保证烟草转化效率，本公司不接受客户提供的农杆菌。客户如有特殊检测要求，双方协商具体服务事项。亚细胞定位技术服务内容包括：亚细胞定位预测、基因克隆、载体构建与验证、农杆菌转化、侵染、共聚焦显微镜观察拍照。各项目可整体检测也可单独检测。

5. 收费方式：后付费，零预收费启动项目。亚细胞定位和共定位有荧光信号就收费，没有荧光信号不收费。待项目完成数据交与客户认可后，30日内开具发票，转账付费。

6. 结果确认。客户收到本公司的结题报告后，请务必在7日内确认结果，如有问题及时反馈售后人员，到期如无异议，默认该项目成功。

7. 本合作仅限于为科研单位或个人提供亚细胞定位技术服务，所交付的产物仅作为实验室的研究材料使用，不具备商业用途，合作双方应在国家相关法律法规允许的范围内使用，违者对产生的后果自行负责，本公司不承担任何连带责任。

客户提供材料

1. 目的基因序列，名称等注释信息，如果特别要求请在备注中注明；

2. 如客户需提供质粒，质粒浓度为>100ng/μl，荧光蛋白的颜色或者激发光和发射光波长等信息；

3. 尽可能详细的填写“亚细胞定位服务登记表”，发送至售前销售的微信 15301627726 或邮箱 sales01@pujiebio.com；

反馈客户结果

1. 客户委托本公司构建载体，项目结束后提供构建好的载体及相关测序结果。

2. 激光共聚焦显微镜观察拍照。每个载体提供三组图片数据，每组数据包括荧光亚细胞定位图，DIC图和Merge图；如果是亚细胞共定位，每组数据包括荧光亚细胞定位图，细胞器Marker荧光定位图，DIC图和Merge图。

3. 提供包含详细实验步骤、分析整理图片结果的结题报告，以及亚细胞定位的原始图片。《亚细胞定位技术服务结题报告-模板》【注：此模板仅供参考】

【备注：内质网在细胞质内侧广泛分布，是一个连续的膜系统，从核膜一直延伸到细胞膜，广泛分布，结构较为分散。高尔基体分布在细胞核膜附近，是由膜囊堆叠形成的较为集中的结构，膜比较有规律，数量较少。但植物细胞由于中央大液泡的影响，会将细胞内的成分推挤到更靠近细胞膜的地方，因此有些高尔基体和内质网定位的蛋白观察到有点类似于细胞膜、细胞核的定位。如果要具体确认定位，则需要做高尔基体，内质网的共定位。】

常见问题及解析（Q&A）

Q：构建亚细胞定位载体时，目标蛋白连在荧光蛋白的N端更好，还是C端更好？

A: 大部分文献一般都是把目标蛋白连在N端，GFP放在C端；如果目标蛋白连在C端，在加工过程中有可能信号肽 会连同GFP一起被切掉 ，导致荧光淬灭，或荧光信号弱。也有少部分目标蛋白必须连在C端才有信号。极少的目标蛋白需要连入GFP中间才有信号。融合在荧光蛋白N端的目标蛋白一般无法得到过氧化物酶体的定位结果，融合在荧光蛋白C端的目标蛋白一般无法得到线粒体、质体的定位结果。选择融合位置时需考虑蛋白质的性质和功能，有时可能需要尝试两种方式以确定最佳融合位点。

Q：为什么亚细胞定位实验结果和预期不符？

A: 不同物种或品种的植物细胞在翻译表达基因时，其表达模式和影响因子不同。建议实验时尽可能选用与目的基因来源相近的受体材料进行表达。不同时间点取样拍照，定位位置不同。活体细胞状态下，某些蛋白有信号肽，会移动。部分蛋白在特定条件（如缺氧）下会发生亚细胞定位改变，需查阅文献确认正常定位。GFP等标记物融合位置（N端/C端）可能改变定位结果，需根据蛋白序列调整融合策略。有些预期不符的情况可能是由‌仪器分辨率限制的，低分辨率仪器可能无法区分相邻亚细胞结构（如内质网与细胞膜）；‌荧光波长与仪器不匹配会导致信号检测偏差，需更换标记物或调整仪器设置。建议优先排查实验操作问题，若仍无法解决则需考虑蛋白自身特性或物种差异。查阅数据库信息或者参考文献，明确靶蛋白的定位情况，设置空白对照。

Q：为什么不同的受体材料有时得到的定位结果不一样？

A: 不同物种或品种的植物细胞在翻译表达基因时，其表达模式和影响因子不同。受物种差异的影响，同一个载体在不同的受体材料中表达的位置可能不同。建议实验时尽可能选用与目的基因来源相近的受体材料进行表达。

Q：已知一个基因，其翻译的蛋白很可能是分泌蛋白，用烟草做亚细胞定位的话，后期需不需要做质壁分离处理？如果需要，应该怎么做？

A: 当目标蛋白为分泌肽或含信号肽结构，预测定位于细胞外基质时，可先做初步定位，观察其是否存在胞质弥散或细胞边缘聚集的定位情况，也可对分泌蛋白进行监测‌，分别在侵染后24h、48h、72h取样，观察荧光从内质网→高尔基体→囊泡的动态迁移‌。如有，可追加质壁分离验证；对于明确为胞内细胞器定位的蛋白则无需质壁分离。

‌质壁分离的最佳处理时间‌是在荧光蛋白充分表达后（农杆菌注射后48-72小时）进行，过早处理易因蛋白表达不足导致信号微弱。

‌【操作流程】：① ‌叶片处理‌：切取表达荧光融合蛋白的烟草叶片（约1cm²）。② 浸入 ‌0.5–0.8 M蔗糖溶液‌（高渗液）中，避光孵育10-15分钟。③‌ 显微观察‌：将叶片置于载玻片上，加盖玻片轻压，激光共聚焦显微镜下观察。‌原生质体与细胞壁分离形成空隙表明质壁分离成功。‌④ 定位判定荧光信号位于空隙处（质外体），或附着于收缩的原生质体（膜结合）。

【注意事项】：① 质壁分离会破坏细胞膜完整性并改变蛋白分布环境，而分泌蛋白的定位需在活细胞或接近生理状态下观察，以保持其动态分泌过程的真实性。实验处理不当会导致细胞破裂或死亡，荧光信号弥散。因此‌蔗糖浓度需要优化，蔗糖处理时间严格控制在10-15分钟。② 渗透胁迫可诱导蛋白错误定位（如应激蛋白向膜迁移）‌，应该进行关键对照实验设计，观察排除。③ 为避免细胞边缘聚集的蛋白被误判为膜定位，可通过细胞收缩后观察荧光是否随细胞膜移动来区分，也可与膜定位marker共定位。‌同时也要连续扫描同一细胞区域（间隔5-10分钟），确认信号无弥散或偏移，从而对定位稳定性进行验证。‌

Q：为什么要提供GFP空载的对照图片？

A: 作为整个实验过程中的操作参照，可排除因实验操作而导致目的基因没有荧光信号的影响。作为载体体系的参照，确认构建载体时所使用的载体是可正常表达荧光蛋白的。

Q：GFP是细胞全局定位，如果连入基因后跟GFP定位一样，是否这种定位无意义？

A: 这种定位只能说和GFP一样，但为了说明蛋白某种功能，必须在需要行使功能的细胞器里有定位；如果全局都有，证明起码这个蛋白是能行使功能的，GFP一般不影响蛋白的亚细胞定位。

Q：拍摄时为什么有明场通道？

A: 显示细胞状态，有活力的细胞应该有正确且明显的细胞形态，变形或破碎的细胞说明此时细胞不是最适状态或细胞已死亡。显示荧光确实是细胞内蛋白表达的，而不是细胞碎片及杂质产生的杂光。

Q：如何解释蛋白质在多个亚细胞结构中定位？

A: 蛋白质可能在不同条件下或发育阶段中具有不同的功能，因此可能存在于多个亚细胞结构中。这可能需要通过进一步的实验，如条件变化下的重复实验或使用特定抑制剂，来验证蛋白质的动态定位。

Q：荧光信号弱或不稳定，如何改善？

A: 优化蛋白表达启动子，增加翻译增强子，或添加高效的5`UTR（对部分蛋白，可提高蛋白表达量），或尝试不同的转录终止子。优化烟草培养条件，确保培养条件稳定，避免光照和温度的剧烈变化；提高侵染农杆菌的浓度。

Q：如何避免荧光淬灭？

A: 使用抗光漂白的荧光蛋白变体，如EGFP，以及在实验过程中尽量减少光照时间，使用低功率光源，可以减少荧光淬灭。

Q：对基因做定位预测后，是否可以直接做共定位？

A: 不同的预测网站有不同的计算方法，同一个基因在不同的预测网站也可能得出不同的定位结果。另外所有的结果都应是基于实验得到的，对于不清楚可能定位在哪里的基因，一般推荐先做普通定位，根据普通定位的结果再决定做哪种细胞器的共定位。

Q：共定位系数假阳性什么原因？

A: 通道串色或过曝。严格设置单标对照，降低激光功率或增益。

Q：细胞死亡或形态异常是什么原因？

A: 侵染操作不当或荧光蛋白过表达。应减少质粒用量，降低农杆菌浓度，严格按照侵染步骤操作。

表格下载

亚细胞定位服务登记表